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蛋白质分离纯化程序步骤

日期:2020-09-23 19:19
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摘要:
 
()材料的预处理及细胞破碎
 
分离提纯某种蛋白质时,先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态,不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有:
 
1. 机械破碎法
这种方法是利用机械力的剪切作用,使细胞破碎。常用设备有,速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。
 
2. 渗透破碎法
这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。
 
3. 反复冻融法
生物组织经冻结后,细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便,但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。
 
4. 超声波法
使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。
 
5. 酶法
如用溶菌酶破坏微生物细胞等。
 
() 蛋白质的抽提
 
通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提,抽提缓冲液中般要加入表面活性剂(十烷基磺酸钠、tritonX-100等),使膜结构破坏,利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中,应注意温度,避免剧烈搅拌等,以防止蛋白质的变性。
 
(三)蛋白质粗制品的获得
 
选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法:
 
1. 等电点沉淀法
不同蛋白质的等电点不同,可用等电点沉淀法使它们相互分离。
 
2. 盐析法
不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同,所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质,并能再度溶解而不变性。
 
3. 有机溶剂沉淀法
中性有机溶剂如乙醇、丙酮,它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低,进而从溶液中沉淀出来,因此可用来沉淀蛋白质。此外,有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层,促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性,使用该法时,要注意在低温下操作,选择合适的有机溶剂浓度。
 
(四)样品的进步分离纯化
 
用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质般含有其他蛋白质杂质,须进步分离提纯才能得到有定纯度的样品。常用的纯化方法有:凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较纯度的蛋白质样品。
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