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双向电泳完整操作步骤

日期:2020-09-20 08:34
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摘要:

()第向等电聚焦
1. 从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液(I)(不含DTT,不含Bio-Lyte)小管(1ml/管),置室温溶解。
2. 在小管中加入0.01g DTT, Bio-Lyte 4-6、5-7各2.5ml,充分混匀。
3. 从小管中取出400ml水化上样缓冲液,加入100ml样品,充分混匀。
4. 从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条(17cm pH 4-7),室温中放置10分钟。
5. 沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样,中间的样品液定要连贯。注意:不要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的分布。
6. 当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后,用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。
7. 分清胶条的正负,轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上,使得胶条的正(标有+)对应于聚焦盘的正。确保胶条与电紧密接触。不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上,因为这些溶液不会被胶条吸取。同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。如果已经产生气泡,用镊子轻轻地提起胶条的端,上下移动胶条,直到气泡被赶到胶条以外。
8. 在每根胶条上覆盖2-3ml矿物油,防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油,沿着胶条,使矿物油滴滴慢慢加在塑料支撑膜上。
9. 对好正、负,盖上盖子。设置等电聚焦程序。
10.聚焦结束的胶条。马上进行平衡、第向SDS-PAGE电泳,否则将胶条置于样品水化盘中,-20℃冰箱保存。
()第向SDS-PAGE电泳
1. 配制10%的丙烯酰胺凝胶两块。配80ml凝胶溶液,每块凝胶40ml,将溶液分别注入玻璃板夹层中,上部留1cm的空间,用MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇封面,保持胶面平整。聚合30分钟。般凝胶与上方液体分层后,表明凝胶已基本聚合。
2. 待凝胶凝固后,倒去分离胶表面的MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇,用MilliQ水冲洗。
3. 从-20℃冰箱中取出的胶条,先于室温放置10分钟,使其溶解。
4. 配制胶条平衡缓冲液I。
5.在桌上先放置干的厚滤纸,聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另份厚滤纸用MilliQ水浸湿,挤去多余水分,然后直接置于胶条上,轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。
6. 将胶条转移至溶涨盘中,每个槽根胶条,在有胶条的槽中加入5ml胶条平衡缓冲液I。将样品水化盘放在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。
7. 配制胶条平衡缓冲液II。
8. 第次平衡结束后,彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I。并用滤纸汲取多余的平衡液(将胶条竖在滤纸上,以免损失蛋白或损坏凝胶表面)。再加入胶条平衡缓冲液II,继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。
9. 用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。将处理好的第向凝胶放在桌面上,长玻璃板在下,短玻璃板朝上,凝胶的顶部对着自己。
10.将琼脂糖封胶液进行加热溶解。
11.将10×电泳缓冲液,用量筒稀释10倍,成1×电泳缓冲液。赶去缓冲液表面的气泡。
12.第次平衡结束后,彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液II。并用滤纸汲取多余的平衡液(将胶条竖在滤纸上,以免损失蛋白或损坏凝胶表面)。
13.将IPG胶条从样品水化盘中移出,用镊子夹住胶条的端使胶面完全浸末在1×电泳缓冲液中。然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。其余胶条同样操作。
14.将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上,短玻璃板面对着自己。在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。
15.用镊子、压舌板或是平头的针头,轻轻地将胶条向下推,使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡。在用镊子、压舌板或平头针头推胶条时,要注意是推动凝胶背面的支撑膜,不要碰到胶面。
16.放置5分钟,使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。
17.在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转移至电泳槽中。
18.在电泳槽加入电泳缓冲液后,接通电源,起始时用的低电流(5mA/gel/17cm)或低电压,待样品在完全走出IPG胶条,浓缩成条线后,再加大电流(或电压)(20-30mA/gel/17cm),待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。
19.电泳结束后,轻轻撬开两层玻璃,取出凝胶,并切角以作记号(戴手套,防止污染胶面)。
20.进行染色。  

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