文章详情

蛋白质浓度测定(双缩脲法)实验先容

日期:2020-09-28 19:48
浏览次数:826
摘要:实验原理 测定蛋白质的定量方法有很多,目前常用的有凯氏定氮法;比色法主要包括双缩脲法、Folin-酚试剂法及 染料结合法;紫外分光光度法等 双缩脲(Biuret)法:在碱性溶液中,双缩脲(H2N—CO—NH—CO—NH2)与价铜离子作用形成紫红色的络合物,这反应称双缩脲反应。凡分子中含个或个以上酰胺基(—CO—NH2),或与此相似的基团[如—CH2—NH2,—CS—NH2,—C(NH)NH2]的任何化合物,无论这类基团直接相连还是通过个碳或氮原子间接相连,均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键(—CO—NH—),可发生双缩脲反应,且呈色强度在...
实验原理

测定蛋白质的定量方法有很多,目前常用的有凯氏定氮法;比色法主要包括双缩脲法、Folin-酚试剂法及 染料结合法;紫外分光光度法等
双缩脲(Biuret)法:在碱性溶液中,双缩脲(H2N—CO—NH—CO—NH2)与价铜离子作用形成紫红色的络合物,这反应称双缩脲反应。凡分子中含个或个以上酰胺基(—CO—NH2),或与此相似的基团[如—CH2—NH2,—CS—NH2,—C(NH)NH2]的任何化合物,无论这类基团直接相连还是通过个碳或氮原子间接相连,均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键(—CO—NH—),可发生双缩脲反应,且呈色强度在定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比,可用比色法测定蛋白含量。与同样处理的蛋白标准液比较,经计算或查标准曲线即可求出血清总蛋白质含量。
实验试剂

1.6mol/L氢氧化钠溶液  
称取氢氧化钠(NaOH,纯)240g,用新鲜蒸馏水配制成1L,置室温贮存在密封的聚乙烯瓶里。
2.双缩脲试剂  
称取未失结晶水的硫酸铜(CuSQ·5H20) 3.0g,溶于500m1新鲜蒸馏水中,加酒石酸钾钠(NaKC4H4O6.4H2O)9.0g,碘化钾(KI)5.0g,待安全
溶解后,加入6mol/L氢氧化钠溶液100ml,后加蒸馏水至1L。室温贮存在密闭的聚乙烯瓶里,约稳定6个月。
3.蛋白标准液 
可用商品血清蛋白标准液或定值质控血清为标准。亦可收集混合新鲜血清,用凯氏定氮法标定后,加叠氮钠防腐(叠氮钠的终浓0.5~1.0g/L),冰冻
保存。
实验设备

恒温水浴箱、722(721)分光光度计、吸管、试管、坐标纸
实验步骤

1.   配制20g/L蛋白标准液  如蛋白标准液浓度为70g/L,则取此液2m1,加入新鲜蒸馏水5ml,混匀即成。
2.   按表操作
 
    加入物(ml)  空白管   1    2    3    4    5 测定管
20g/L蛋白标准液     ~    0.1    0.2   0.3       0.4       0.5        ~   
蒸馏水    0.5    0.4    0.3   0.2    0.1   ~      0.4
待测样品液体   ~     ~    ~       ~     ~      ~        0.1
双缩脲试剂     3.0   3.0     3.0       3.0        3.0       3.0       3.0     
相当血液蛋白质(g/L)      ~      20    40    60    80   100    
混匀,置37℃水浴10min(或25℃30min),用540nm波长比色,以空白管调零,读取各管吸光度。
3.   标准曲线绘制
1—5为标准曲线管,测得吸光度后,以吸光度为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。
4.   实验结果
根据测定管吸光度,从标准曲线查找相对应的总蛋白浓度。 
 
注意事项

1.双缩脲试剂中,加入酒石酸钾钠,Cu2 形成稳定的络合铜离子,以防止CuSO4·5H20不稳定形成Cu(OH)2沉淀。酒石酸钾钠与CuSO4·5H20之比
      不低于3:1,加入KI作为抗氧化试剂。
2.双缩脲试剂要封闭贮存.防止吸取空气中的氧化碳。
3.本法各种蛋白质的显色程度基本相同,重复性好,几乎不受温度影响,唯缺点是灵敏度较低。
4.黄疸血清.严重溶血对本法有明显干扰。

5.本法绘制的标准曲线是条通过原点的直线,在100g/L浓度之内呈良好的线性关系。


乐白家娱乐登录-在线游戏官网专业生产:乐白家官网、三用乐白家官网、暗箱式乐白家官网、暗箱三用乐白家官网、暗箱乐白家官网、手提式乐白家官网、三用乐白家官网暗箱式、紫外检测仪、部分收集器、恒流泵、蠕动泵、凝胶成像系统、凝胶成像分析系统、化学发光成像分析系统、光化学反应仪、旋涡混合器、漩涡混合器、玻璃层析柱、梯度混合器、梯度混合仪、核酸蛋白检测仪、玻璃层析柱、荧光增白剂测定仪、馏分收集器、切胶仪、蓝光切胶仪、层析系统等产品。欢迎来电咨询。

乐白家娱乐登录-在线游戏官网 www.wzaoli.com
电话:021-66030766   36162366 
400免费咨询电话:4000-123-925  
手机:13585698333  18918199710  13501668369  
企业QQ,2880150292,2880150293,2880150290,2880150297

XML 地图 | Sitemap 地图