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荧光定量PCR仪的误区

日期:2020-09-21 19:49
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摘要:荧光定量PCR 因操作方便、运行速度快、实验结果准确,受到越来越多的分子生物学研究者青睐。在实验技术成熟的今天,也许对你来说,难得不是实验技术上的问题——而是选择哪种荧光定量PCR仪——你要征询实验室成员的意见、分析实验室目前乃至将来的需求、平衡实验室的预算,更要详细研究各种富诱惑力的宣传资料。面对各种不同性能的产品,您又该如何选择呢? 先建议大走出认识荧光定量PCR的两个误区: 误区:仪器通道越多越好 随着PCR技术的成熟运用,多重扩增越来越热闹,荧光定量PCR仪也不能幸免。从初ABI企业推出...
荧光定量PCR 因操作方便、运行速度快、实验结果准确,受到越来越多的分子生物学研究者青睐。在实验技术成熟的今天,也许对你来说,难得不是实验技术上的问题——而是选择哪种荧光定量PCR仪——你要征询实验室成员的意见、分析实验室目前乃至将来的需求、平衡实验室的预算,更要详细研究各种富诱惑力的宣传资料。面对各种不同性能的产品,您又该如何选择呢?

先建议大走出认识荧光定量PCR的两个误区:

误区:仪器通道越多越好

随着PCR技术的成熟运用,多重扩增越来越热闹,荧光定量PCR仪也不能幸免。从初ABI企业推出的单通道荧光定量PCR仪发展到如今各个厂都推出4通道、5通道甚至6通道荧光定量PCR仪,眼花缭乱的选择让人无所适从,就有人不小心走进了“通道越多越好”的误区。

在使用有些厂5通道的荧光定量仪时,为了确保实验结果的性和准确性都要在实验中使用ROX(种荧光染料)或专用的Reference dye ,这些荧光染料都必须单独使用个检测通道。这样以来,真正能检测多重PCR荧光信号的有效通道只有4个,而且使用校正染料可能会增加后期的使用成本。有的荧光定量PCR的检测通道是只为自已厂的专用的荧光染料或试剂开放的,有效检测通道也非像宣传资料**称的那么多。在购买前确认荧光定量PCR仪器的有效检测通道尤为重要,不能单单只听宣传。
考虑多重荧光定量PCR的通道数的时候也应该从实验室实际情况出发,多重PCR并非人人适用、人人可用,因为它使实验复杂化了。

误区:real-time PCR仪无需梯度功能

对于使用染料法的定量PCR反应,虽然有各种各样的PCR引物设计App或者经验公式计算熔解温度(Tm值),但运用的公式不同、引物序列不同,Tm值的差异会很大。引物的熔解温度决定了退火温度。而且模版中碱基的组合千变万化,对于特殊片断,经验公式得到的数据不定能得出准确的结果,退火温度细微的差异对结果都可能产生决定性的影响,因而“摸条件”度是让人很头疼的问题。梯度PCR的出现部分解决了些问题——在反应过程中每个孔的温度控制条件可以在指定范围内按照梯度变化,根据结果,步就可以摸索出适合的反应条件。

不单退火温度,连变性温度和延伸温度都可以化——对于多种聚合酶混合酶扩增如Invitrogen、Clontech、Promega的多数保真Taq酶来说这个非常重要,因为Taq和校正酶的反应温度可能有显著差异,化延伸温度就显得很重要。

使用有梯度功能的荧光定量PCR可以次完成以往多次实验才能完成的化过程,简化了摸索 PCR反应条件的繁琐实验,既节省实验时间提效率,又节省实验成本。
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